SIMPOSIO DE CHICAGO: MODELOS DE LA ELA

ESTABLECIENDO MODELOS DE LA ELA CON CELULAS MADRE EMBRIONARIAS DERIVADAS DE NEURONAS MOTORAS.

A pesar de los progresos recientes en la creación de modelos de la enfermedad, se ha comprobado la dificultad para mimetizar la degeneración selectiva in vitro de poblaciones neuronales motoras vulnerables en los pacientes de ELA. Las células madre embrionarias pueden ser dirigidas con gran eficiencia a su diferenciación en neuronas motoras. Nosotros hemos utilizado neuronas motoras derivadas de células embrionarias del ratón para buscar los agentes lesivos que provocan la degeneración selectiva de las neuronas motoras en la ELA portadoras del gen modificado SOD1-G93A.

El efecto de agentes lesivos identificados se probó a continuación en neuronas motoras derivadas con la técnica de inducción de células madres pluripotenciales (iPS) en controles humanos y en pacientes. Las neuronas motoras así derivadas son de características cervicales. Para crear mejor un modelo de enfermedad, puede ser así mismo importante programarlas hacia poblaciones vulnerables a la ELA y resistentes a la ELA, respectivamente. Nosotros demostramos que la diferenciación de células madre puede programarse con precisión para distinguir subtipos de neuronas motoras mediante la expresión inducible de factores de transcripción. Planeamos utilizar estas poblaciones para el mejor análisis de los mecanismos celulares y moleculares de la neurodegeneración selectiva de la ELA y para la búsqueda de agentes neuroprotectores.

LAS NEURONAS MOTORAS DERIVADAS DE CELULAS MADRE EMBRIONARIAS GENERADAS A PARTIR DEL RATON TDP-43 (A315T) DESARROLLAN UNA PATOLOGIA SIMILAR A LA ELA.

Tales neuronas motoras remedan fenotipos de ELA similares a la patología de la ELA humana. Estos estudios servirán para establecer modelos in vivo de neuronas motoras derivadas de células madre embrionarias en estudios preclínicos para investigar los mecanismos tanto de la ELA esporádica como los de la ELA familiar. Finalmente, el factor responsable de la muerte de las neuronas motoras puede usarse como biomarcador para el diagnóstico precoz de la ELA, para cuantificar la progresión de la enfermedad y para desarrollar nuevos tratamientos destinados a mitigar la degeneración de las neuronas motoras en la ELA.

EL PEZ CEBRA (*) EN LA IDENTIFICACION DE MODIFICADORES DE LA ELA.

Utilizando un modelo de ELA en el pez cebra previamente establecido, realizamos una búsqueda basada en moléculas de morfolino (inductoras de cambios en la expresión genética) para identificar genes que modifiquen el fenotipo. La supresión del gen ortólogo (gen homólogo separado por un evento de especiación) del EphA4 en del pez revertía la axonopatía inducida por la SOD1 mutante. Análogamente, la reducción de la expresión del gen EphA4 o los antagonistas del EphA4 atenuaban la degeneración de la neurona motora en modelos del ratón y la rata. El efecto protector era especialmente visible en las neuronas motoras grandes, siendo conocida su vulnerabilidad en la ELA. Esas células grandes expresan niveles altos del EphA4, y este receptor inhibe su capacidad de ramificación. En pacientes de ELA, la menor expresión de EphA4 se asociaba a una edad de comienzo más tardío y una supervivencia más prolongada. Además, las mutaciones raras con pérdida de función del gen EphA4 se asocian a una prolongación de la supervivencia inusualmente larga.

(*) Nota: Es especialmente apreciado por su homología genética con el hombre (compartimos con estos peces más del 80% del genoma) que permite que los resultados obtenidos de los fármacos probados en estos animales sean potencialmente extrapolables al ser humano.

Sus embriones son transparentes, algo que hace posible observar los efectos de estos medicamentos en sus órganos internos en formación.

Otra de las ventajas de este pez es su capacidad reproductiva -la hembra pone hasta 200 huevos-, continua- se reproducen durante todo el año- y rápido desarrollo -sus órganos se forman en sólo 24 horas-, gracias a los cuales se pueden realizar diferentes experimentos en una misma generación de animales, investigar la evolución de las patologías e identificar las causas de las enfermedades investigadas.

Este pez tropical posee también la cualidad de regenerar los órganos que le son parcialmente amputados, lo que amplia las capacidades de investigación en este campo que tiene como horizonte la recuperación de las lesiones medulares.

Pueden criarse de modo tal que los mutantes pueden ser investigados y propagados y es además, el primer vertebrado en el que se ha intentado una mutagénesis intensiva.¹

Su pequeño tamaño hace fácil su almacenaje, ya que caben hasta un centenar de animales en contenedores de un litro de agua, y su sencillo mantenimiento decantan finalmente a favor del pez cebra las preferencias de los científicos como animal de laboratorio en el siglo XXI.

Los genes del pez cebra son muy dóciles de estudiar ya que los embriones son sensibles a las moléculas antisentido de Morfolino y por tanto, este método puede ser utilizado para analizar si un gen dado es importante para una función en particular.¹

LA PERDIDA DE TDP-43 PROVOCA HIPOPERFUSION Y DISTROFIA MUSCULAR

Las mutaciones autosómicas dominantes de la proteína de unión al ADN TDP-43 provocan esclerosis lateral amiotrófica y degeneración del lóbulo frontotemporal con positividad a las inclusiones de ubiquitina y TDP-43.

Hemos generado una pérdida de la función de la TDP-43 en el pez cebra, causándole una mutación mediante la modificación genómica de nucleasa con dedos de cinc para determinar la función fisiológica de la TDP-43. Los embriones del pez cebra, transparentes y de fácil acceso facilitan la identificación de fenotipos y la señalización de vías asociadas a la pérdida de función de la TDP-43. Las mutaciones homozigóticas con pérdida de función en el pez cebra tardbp no muestran un fenotipo morfológico debido a la compensación mediante una variante de empalme de la tardbpl. Las mutaciones homozigóticas dobles muestran una distrofia muscular extrema como fenotipo. Adicionalmente, muestran una fuerte reducción de la circulación sanguínea y una dramática pérdida de patrón de los vasos intersomíticos, déficit de la expansión de los axones motores espinales y muerte precoz. Un examen proteómico cuantitativo identificaba la desregulación de proteínas en los mutantes con pérdida de función de la TDP-43. Sorprendentemente, una desregulación similar de estas proteínas se observa en el cortex frontal de los pacientes con demencia frontotemporal con inclusiones de TDP, sugiriendo un mecanismo de enfermedad por pérdida de función.

BUSQUEDA QUIMICO-GENETICA DE MODIFICADORES DE LA TDP-43 IN VIVO Y DESCUBRIMIENTO DE FÁRMACOS PARA LA ELA

Hemos probado unas 3700 moléculas aprobadas por la FDA e identificado 17 compuestos que reducían consistentemente la toxicidad de la TDP-43 en gusanos y peces. Estos compuestos también reducían la toxicidad de la FUS en nuestros modelos de peces y gusanos. Dentro de este grupo hay compuestos ligados a la respuesta del estrés del retículo endoplasmático así como algunos neurolépticos. Nuestros datos sugieren que el mal plegamiento de las proteínas y la disfunción sináptica contribuyen a la toxicidad de la TDP-43.

LA FUS EN LA ELA: NUEVOS MODELOS CELULARES Y ANIMALES DE LA ENFERMEDAD DE NEURONA MOTORA.

Las mutaciones de la proteína ligada al ARN FUS (de fusión en sarcoma) han mostrado causar ELA familiar. Sin embargo, no está claro cómo las mutaciones de la FUS llevan a la degeneración de la neurona motora en la ELA. Nosotros hemos desarrollado un modelo en la Drosophila para examinar la toxicidad de la FUS. La expresión del tipo nativo de la FUS o FUSR521G inducía la toxicidad progresiva de una forma dependiente de la dosis y de la edad en varios tejidos, incluyendo los ojos y las neuronas. En particular, la expresión de la FUS o de la FUSR521G en las neuronas motoras, perjudicaba significativamente la capacidad locomotriz para el vuelo de las larvas y de los adultos. Las estructuras presinápticas de las uniones neuromusculares estaban desorganizadas y las neuronas motoras de las cuerdas nerviosas ventrales estaban desorganizadas y desarrollaron una apoptosis como se hizo evidente mediante tinción nuclear y mediante análisis TUNEL. Sorprendentemente, la pérdida de la secuencia de localización nuclear C-terminal de la FUS provocaba menos efectos en comparación con los causados por la FUS o la FusR521G, sugiriendo que se requiere la localización nuclear para la toxicidad de la FUS. De hecho, descubrimos que la pérdida del caz en la Drosophila conduce a defectos graves de crecimiento en los ojos y las cuerdas neuronales ventrales. La pérdida de caz en las neuronas motoras conduce a una discapacidad locomotriz y la disrupción de la unión neuromuscular pero no induce la muerte celular apoptótica. EL hallazgo sugiere que aunque tanto la sobreexpresión como la supresión de la FUS/caz causan fenotipos similares, los mecanismos subyacentes para la toxicidad con aumento o pérdida de función seguramente son distintos. Por tanto, algunos casos de enfermedad provocados por las mutaciones de la FUS son seguramente debidos a la pérdida de función in vivo. Hemos identificado recientemente la fosforilación de la FUS como un suceso crítico post –translacional que regula la toxicidad de la FUS.

FUSIOPATÍA EN LAS CELULAS Y EXPRESIÓN EN RATONES TRASGÉNICOS DE UNA FORMA DE PROTEÍNA HUMANA PROPENSA A LA AGREGACION

De acuerdo con observaciones previamente descritas, en las células SH-SY5Y, la expresión de variantes de la FUS carentes de la señal de localización nuclear funcional desencadenaba la formación de gránulos de estrés y la acumulación de proteínas expresadas dentro de ellos. Sin embargo, la variante truncada de la FUS formaba diversos tipos de estructuras citoplasmáticas en las células SH-SY5Y y en otros tipos de células cultivadas. Estas estructuras ofrecían características morfológicas y bioquímicas características de inclusiones intracelulares consistentes en agregados de proteínas. Los ratones transgénicos que expresaban la FUS truncada en su extremo C-terminal desarrollaban en la mayoría de las neuronas una patología neuronal a los 3-5 meses de edad, que conducía a una discapacidad grave y a la muerte en el término de 1 a 2 semanas tras el inicio de los signos clínicos. Múltiples inclusiones citoplasmáticas FUS – positivas se observaban en las neuronas motoras superiores e inferiores. La fase terminal de la enfermedad se caracterizaba por lesión grave y pérdida de las fibras motoras mielínicas en las raíces ventrales con menor afectación de las fibras sensitivas de las raíces dorsales. La pérdida de neuronas motoras inferiores era selectiva para determinadas poblaciones limitadas y coincidía con el grado de neuroinflamación en la región correspondiente. La segmentación C-terminal de la FUS aumenta dramáticamente su capacidad para agregarse y formar inclusiones citoplasmáticas.  En conclusión, la expresión de la forma truncada de la proteína FUS desencadena una fusopatía en células cultivadas y en ratones transgénicos. Nuestro modelo de ratón transgénico recapitula muchas características fundamentales de la ELA.