sábado, 26 de diciembre de 2015

ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES DEGENERATIVAS: HALLAZGOS SOBRE GENES CRUCIALES Y MAQUINARIA CELULAR



La esclerosis lateral amiotrófica continúa siendo una enfermedad refractaria, tanto en términos de patogénesis como de terapia. Su heterogeneidad parece ser uno de los principales obstáculos en contra del desarrollo de tratamientos eficaces apuntando, además, a la necesidad de desarrollar un tratamiento médico adecuado a las características de cada paciente.

Los progresos en genética y biología celular han dilucidado algunos supuestos mecanismos patogénicos clave, abriendo una ventana a la esperanza futura de tratamientos que modifiquen el curso de la enfermedad. El espectro del conocimiento de las causas genéticas de la ELA se enriquece rápidamente y, en el año 2015, diversos genes nuevos, como el CHCHD10, NEK1 y el TBK1 han aparecido en escena. EL TBK1 parece ser de particular interés, tanto si consideramos el nuevo enfoque en dos pasos GWAS usado para su identificación, y su posible mecanismo patogénico. Cirulli y cols. realizaron una secuenciación del exoma completo en 2869 pacientes de ELA y 6405 controles. El TBK1 se asoció ala enfermedad, así como varios genes cuya asociación de conocía de antemano, (como SOD1, VCP y el TARDBP) , confirmando la calidad del análisis. El TBK1 codifica la kinasa1 ligada al TANK, una proteína involucrada en la autofagia y la inflamación, dos mecanismos patogénicos ya propuestos para la ELA. Curiosamente, la kinasa 1 ligada al TANK se une y fosforila a la optoneurina y ala p62, dos proteínas codificadas respectivamente por los genes OPTN y SQSTM1 relacionados con la ELA, y parece ser un componente importante de la vía de los agregados de proteínas mal plegadas, vía requerida para la eliminación de las inclusiones patológicas de ribonucleoproteínas. Los pacientes con la mutación TBK1 expresan diversos fenotipos, incluyendo la ELA pura, la demencia frontotemporal y la asociación de ambas.
Otro paso importante para revelar los mecanismos moleculares que subyacen a la ELA es la identificación de dos grupos independientes de transportes nucleares deficitarios en individuos portadores de la expansión repetitiva del hexanucleótido GGGGCC en el primer intron del gen C9ORF72. Este defecto genético puede verse en aproximadamente el 50% de pacientes con ELA familiar y en el 5% de casos de ELA esporádica. Zhang y col y Freibaun y cols identificaron la  RanGAP, una proteína interactuante del GGGGCC en el modelo de Drosophila, como un regulador clave del transporte nucleocitoplasmático que actúa en el nivel del aparato externo del poro nuclear. El transporte nuclear de la RanGAP se encontraba alterado en el modelo de Drosophila de las expansiones repetitivas del C9ORF72, y era rescatada con éxito mediante tratamiento con oligonucleótidos antisentido. Este mecanismo patogénico novedoso proporciona una nueva vía prometedora para el tratamiento de la ELA.
Se esperan avances adicionales en la comprensión de los mecanismos patogénicos de las enfermedades neurodegenerativas y en la identificación de posibles vías de tratamiento a partir del análisis del control de transcripción del ARN. La alteración del procesamiento del ARN provoca diversas enfermedades, tanto neurodegenerativas como mitocondriales. La ELA causada por la mutación en el gen TARDBP y la atrofia espinal muscular tipos 1 y 2 son ejemplos de enfermedades relacionadas con la alteración en los procesos de corte y empalme del ARN.. El corte y empalme alternativos del ARN juega un papel esencial para que los genes individuales codifiquen múltiples proteínas. Este mecanismo de amplificación del proteoma posee una influencia biológica enorme y un gran nivel de complejidad. Sin embargo, sólo se conoce parcialmente el grado en el que las variantes de nucleótidos simples pueden influir en el corte y empalme alternativo del ARN.
Nuestro genoma se puede asimilar a un libro de instrucciones para construir y mantener nuestro organismo. Las instrucciones de nuestro genoma, sin embargo, están escritas con una sintaxis muy sorprendente. Los mensajes de nuestros genes contienen palabras con significado separadas por letras sin sentido. Para producir una frase inteligible a partir de los mensajes genómicos, las partes sin sentido han de eliminarse y las partes con significado deben ser empalmadas.

El dogma central de la biología molecular establece que las moléculas de ADN que componen nuestros genes se copian en forma de moléculas de ARN, las cuales a su vez se traducen en forma de proteínas. De esta manera, la secuencia de nucleótidos que establece la identidad de una molécula de ADN es descodificada para producir la secuencia de aminoácidos que establece la identidad de una proteína.

Volviendo a la analogía entre los mensajes genéticos y el lenguaje humano, las secuencias del ADN -y de su copia, el ARN- que codifican para aminoácidos están separadas en nuestro genoma por secuencias sin sentido aparente, que han de eliminarse para generar un mensaje genético coherente. El proceso de eliminación de secuencias sin sentido (denominadas técnicamente "intrones") y de empalme de las secuencias codificantes (denominadas "exones") recibe en inglés el nombre de "Splicing" (Figura 1).


Figura 1. La ruta de la expresión génica en organismos multicelulares. Los genes son fragmentos de ADN de nuestros genomas que se copian en forma de precursores de ARN mensajero (Pre-ARNm). Éstos contienen secuencias codificantes (contenidas en exones) separadas por secuencias no codificantes (intrones) que se eliminan por medio del proceso de Splicing para dar lugar a ARN mensajeros maduros (ARNm) que los ribosomas traducen en proteínas. Las proteínas llevan a cabo funciones estructurales y enzimáticas en nuestras células.

En un gen humano típico, la información está contenida en 7-10 exones separados por intrones, donde los intrones son normalmente unas diez veces más largos que los exones. Para llevar a cabo este proceso de corte y empalme, que ha de realizarse con gran precisión y eficacia, existe en el núcleo de nuestras células una maquinaria molecular muy compleja -entre las de mayor complejidad de nuestros organismos- que se conoce con el nombre de "Spliceosoma" (Wahl et al, 2009).

De la misma forma que una sola palabra puede cambiar el sentido de una frase, el proceso del Splicing puede también cambiar el sentido de los mensajes genéticos. Diferentes tipos de células, o una misma célula en distintas situaciones fisiológicas, pueden interpretar una determinada secuencia del genoma como parte de un exón -es decir, como secuencia codificante- o por el contrario como parte de un intrón -es decir, como secuencias a descartar-. De esta manera es posible producir distintos mensajes genéticos a partir de una única secuencia genómica, un proceso que se conoce como Splicing alternativo (Kalsotra and Cooper, 2011).

Más del 90% de los genes humanos experimentan Splicing alternativo. Mediante este mecanismo se producen diferentes proteínas a partir de un gen, en ocasiones llegando incluso a centenares o miles de variantes. El caso más extremo que se conoce es el del gen Dscam de Drosophila, a partir del que pueden generarse más de 38.000 variantes, importantes para la generación de la identidad celular en el establecimiento de redes neuronales (Nilsen and Graveley, 2010). Aunque se desconocen las funciones específicas de la mayoría de las variantes proteicas -llamadas isoformas- generadas mediante Splicing alternativo, existen numerosos ejemplos de cómo las distintas isoformas de un gen muestran diferencias dramáticas en sus propiedades y funciones biológicas (Nilsen and Graveley, 2010; Kalsotra and Cooper, 2011).
Por ejemplo, en el gen del receptor Fas/CD95, implicado en la activación del proceso de muerte celular programada (conocida también como apoptosis), la inclusión o no del exón 6 -que codifica la región de inserción en la membrana de la célula- da lugar a dos isoformas con propiedades radicalmente distintas (Figura 2).




Figura 2El Splicing alternativo del gen Fas / CD95 controla la muerte celular programada (apoptosis). El exón 6 del gen puede incluirse en ARN mensajeros que codifican para el receptor (Fas R) asociado a la membrana celular, que al unirse al ligando Fas (Fas L) induce la muerte celular programada. Si el exón 6 no se incluye, el ARNm resultante codifica para una forma del receptor que no se asocia a la membrana y que inhibe la apoptosis.

La inclusión del exón 6 da lugar a un ARN mensajero maduro que codifica la versión del receptor que se encuentra unida a la membrana de la célula y que, al unirse al ligando correspondiente, induce la muerte celular programada. Si por el contrario la célula considera el exón 6 como parte de un intrón, el Splicing entre los exones 5 y 7 genera un ARN mensajero que codifica la versión del receptor no unida a la membrana, que es secretada al medio extracelular donde puede unirse al ligando pero sin señalizar al interior celular, inhibiendo el proceso de apoptosis. De esta forma la célula adopta una decisión radicalmente distinta sobre su propio destino (suicidio celular o protección frente a señales que lo inducen) no mediante la transcripción o no del gen, sino mediante el tipo de Splicing alternativo que produce a partir del transcrito primario.
Para terminar, veremos cómo la atrofia muscular espinal (AME) ejemplifica la relevancia de las secuencias reguladoras de Splicing en patologías humanas y las perspectivas para el desarrollo de terapias innovadoras (Kole et al, 2012; Rigo et al, 2012). La AME es la enfermedad genética más frecuente en países occidentales, y está causada por mutaciones en el gen SMN1, que codifica para una proteína importante para la maduración de los complejos del Spliceosoma. Recientemente se ha descubierto que la deficiencia de SMN1 causa alteraciones en el Splicing del gen Stasimon en neuronas que puede explicar al menos una parte de los defectos neuromotores asociados con esta enfermedad (Lotti et al, 2012).

Una segunda copia casi idéntica del gen, SMN2, está presente en el genoma humano. Sin embargo esta copia no es plenamente funcional -y por tanto no puede rescatar los defectos en el gen SMN1 en pacientes con AME- dado que el exón 7 del gen SMN2 no se incluye eficientemente en el ARN mensajero maduro, a diferencia del exón 7 en el gen SMN1, que sí lo hace. Una diferencia de un solo nucleótido entre los exones 7 de SMN1 y SMN2 explica la diferencia en la inclusión del exón entre los dos genes. El efecto del nucleótido diferencial se ha atribuido a una disminución en la afinidad de unión de una proteína estimuladora de Splicing y/o un aumento en la afinidad de una proteína inhibidora de Splicing. Este ejemplo demuestra la sensibilidad del proceso a multitud de secuencias auxiliares y a la actividad de factores antagónicos.

Basándose en detallados estudios mecanísticos, el grupo del Profesor Adrian Krainer, en el Cold Spring Harbor Laboratory, ha desarrollado terapias experimentales en modelos animales para la corrección del Splicing del gen SMN2 y por tanto para la restitución de la función de la proteína SMN en células deficientes en el gen SMN1. De modo similar a la inhibición de secuencias crípticas utilizadas para la corrección de la Progeria que vimos más arriba, este grupo utilizó oligonucleótidos complementarios a una secuencia intrónica que tiene un efecto silenciador sobre el exón 7 del gen SMN2 para estimular su incorporación en los ARN mensajeros maduros y así restituir los niveles de la proteína SMN en neuronas de ratones con varios modelos de AME (Hua et al, 2010). A pesar de potenciales dificultades de esta aproximación, resultados recientes indican que modificaciones químicas pueden conferir una gran estabilidad a los oligonucleótidos utilizados y que incluso la administración periférica de estos compuestos tiene efectos terapéuticos notables (Hua et al, 2011). Estos prometedores resultados han posibilitado la iniciación de ensayos clínicos, con grandes expectativas para el tratamiento de esta enfermedad que hoy es incurable.

Como resumen, la sintaxis partida de nuestros mensajes genéticos se ha aprovechado evolutivamente para ampliar el abanico de funciones de nuestros genes y sus posibilidades de regulación. A su vez, alteraciones en estos mecanismos están en la base molecular de enfermedades genéticas y de patologías complejas como el cáncer. Estudios recientes sugieren que la modulación del Splicing ,mediante drogas dirigidas contra componentes del Spliceosoma o mediante oligonucleótidos dirigidos contra secuencias implicadas en la regulación de Splicing, ofrece terapias innovadoras muy prometedoras.

Sin embargo, solo se conoce parcialmente la cuantía en la que las variantes simples de nucleótidos pueden influenciar el splicing alternativo del ARN .Xiong y cols. mediante una aproximación informática original con una maquina de aprendizaje bioinformática, descubrieron que mas de 20000 variantes simples de nucleótidos, incluyendo sin sentido, nonsense y sinónimos, podrían regular el número de exones de RNA mensajeros específicos de célula. Los autores validaron con éxito su nuevo modelo computacional en la atrofia muscular espinal, la segunda enfermedad autosómica recesiva más frecuente de la infancia y una de las principales causas de muerte en la infancia. Este modelo fiable de predicción expande las posibilidades de los estudios de asociación del genoma completo a través de la identificación de nuevas alteraciones del splicing del ARN causantes de enfermedades que pudieran ser dianas terapéuticas. En genética, un estudio de asociación del genoma completo (en inglés, GWAS ( Genome-wide association study) o WGAS (Whole genome association study) es un análisis de una variación genética a lo largo de todo el genoma humano con el objetivo de identificar su asociación a un rasgo observable. Los GWAS suelen centrarse en asociaciones entre los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) y rasgos como las principales enfermedades. La alteración del balance entre la síntesis de proteínas y su degradación, derivando en una acumulación intracelular de agregados de proteínas anómalamente plegadas y el fallo en el mecanismo de aclaramiento son mecanismos emergentes en la ELA y en la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth. Una respuesta adaptativa primaria contra dichos acúmulos es la fosforilación del factor 2 de iniciación de translación eucariótica (e-IF2alfa) que conduce a la disminución de síntesis de la proteína. La potenciación de esta respuesta autolimitada parece crucial para rescatar a las células de los acúmulos de proteínas mal plegadas. Das y cols. describieron que La sephina 1 se liga selectivamente e inhibe a la subunidad regulatoria de la eIF2alfa fosfatasa y previene, de forma segura, el deterioro molecular, morfológico y motor en modelos de ratón transgénico de ELA asociada a la SOD1 y de la enfermedad de CMT asociada a la proteína cero de la mielina (CMT1B). Estos hallazgos, a la vez que proporcionan una base específica para los tratamientos que incidan sobre la evolución de la ELA y la enfermedad de CMT1B, abren nuevos escenarios para el tratamiento de un amplio espectro de enfermedades asociadas con la acumulación de proteínas mal plegadas.

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